血涂片上估测血小板计数值，原来有5种方法

血小板计数在疾病诊断、治疗、疗效观察中具有重要临床价值，也是输注血小板的主要参考指标之一，准确计数血小板的意义不言而喻。当下细胞自动分析仪是计数血小板的主要手段，该方法有诸多优势，但许多情况下仍需涂片镜检对其结果进行复核复检，本文拟对血涂片上如何估测血小板计数值作一介绍，同时复习一下血小板计数的方法和复检规则。

一、血小板计数方法

血小板计数方法可以分为普通光学显微镜手工计数法、相差显微镜手工计数法、细胞自动分析仪法及流式细胞仪间接计数法。

最初国际上推荐的血小板计数参考方法是以草酸铵溶液为溶血-稀释剂、利用相差显微镜在牛鲍氏计数板上手工计数的方法，当前国内外推荐的参考方法则是流式细胞仪法[1][2]。

手工计数法较为繁琐，影响因素较多，严重影响工作效率，流式细胞仪方法成本高，临床上难以普及，目前临床上常用的主要是细胞自动分析仪法。细胞自动分析仪按原理分为电阻抗法、光散射法和荧光染料结合法，这些分方法在计数健康人血小板时并无明显差别，但血小板数量超出线性范围，特别是数量较低、小红细胞和细胞碎片较多时，电阻抗法计数的准确性较差[3]。

二、血小板自动分析复检规则

无论使用哪种型号的自动分析仪，当计数值超出参考范围或与临床明显不符时,都需要检查样本、操作、质控是否正常，仪器有否报警，血小板直方图、散点图、MPV、PDV等是否有所提示，根据实际情况进行复检。

国际血液学专家组[4]提出的血小板复检规则有（1）新生儿样本首次检测；

（2）超出或低于仪器线性范围；

（3）未出试验结果；

（4）首次结果<100×109/L或>1000×109/L；（5）Delta值超限；

（6）PLT聚集报警；

（7）PLT聚集外的PLT和MPV报警。

遇到上述情况，除了排除各种因素后用仪器复检外，大多要求涂片镜检。

三、涂片镜检对血小板分析的作用

首先，涂片镜检可用于估测血小板数量，并评估仪器计数值的准确性，除此之外还可发现下列异常：

（1）样本异常  小凝块和纤维蛋白丝的存在可使血小板数量降低；

（2）形态大小异常  正常血小板在涂片上为圆形、椭圆形或轻度不规则形，直径在1.5-3μm之间，淡蓝或淡红色胞质中存在相聚或散在的紫红色颗粒。在某些因素影响下或病理生理情况下，血小板会呈杆状、逗点状、蛇形等形状，这些畸形血小板健康人也会出现，超过10%时有临床意义。血小板减少性疾病、血栓性疾病、心血管疾病、血液病、脾切除术后及遗传性巨大血小板病等会出现直径4-7μm大血小板和直径>7μm巨大血小板(可引起血小板计数假性降低)，再障、缺铁性贫血时会出现直径<1.5μm小血小板。在病理生理情况下血小板还出现幼稚、退化、染色、颗粒异常等变化。

（3）血小板分布异常  非抗凝血涂片上，血小板多为3-5个聚集呈簇存在，也有少量散在分布，二者比例约为20:1。血小板无力症、再障等疾病时血小板多散在分布，骨髓纤维化、慢粒、原发性血小板增多症血小板会过度聚集。血小板聚集需要钙离子，常用的EDTA抗凝血涂片上血小板多为散在分布，如果抗凝血涂片上出现血小板聚集、粘附于中性或单核细胞周围而成的卫星现象和大片状聚集，要考虑EDTA依赖性假性血小板减少症。

（4）影响血小板计数的其它因素，如红、白细胞碎片、小红细胞(MCV＜70fl,RDW＞20)等可能致血小板计数假性升高；

（5）通过观察其它细胞形态有助于血液病、传染病、肿瘤等疾病的诊断和病理过程的判断。

四、血涂片上估测血小板计数值方法

血涂片上估测血小板计数与细胞计数仪结果有一定的一致性，熟练掌握可使二者之间的误差在20%以内。血涂片的制备可用自动推片机，也可手工推片，但要求都是头体尾分明、厚薄适宜，干燥后进行瑞氏—吉姆萨染色，在体尾交界处选取红细胞均匀分布、细胞间互相接触但较少重叠区域估测血小板数量。在估测前要在低倍镜或高倍镜浏览全片，特别是边缘部位，有血小板聚集、纤维蛋白丝的涂片可引起评估值偏低，不适合应用。

涂片上评估血小板数值有多种方法，下面介绍几种：

（1）R值法：在油镜下至少观察10个视野，计数所观察视野中血小板总量，计算每油镜视野中血小板平均数量，则血小板估测值（×109/L）=每油镜视野中血小板平均个数×R×109/L。公式中Ｒ值又称视野因子（field factor），传统取值为20，国内专家推荐15[5]。

（2）血小板/白细胞比值法：在涂片体尾交界处计数100个白细胞，同时记录所见血小板数量，则血小板估测值（×109/L）=计数100个白细胞时血小板数量/100个白细胞×白细胞计数值（×109/L）。其中白细胞计数值为细胞计数仪的计数结果。

（3）血小板/红细胞比值法：在红细胞均匀分布的区域计数一定量（1000个以上）的红细胞，同时记录血小板数量，求得血小板与红细胞比值，将此比值乘以细胞分析仪测定同一标本的红细胞计数值即可得到血小板估测值。

(4)线性方程法：选取一定数量的标本，同上制备血涂片，用高倍镜在体尾交界计数10个视野的PLT个数，计算平均每个高倍视野下血小板个数，以此数值为X轴，以细胞计数仪计数的血小板值为Y轴，做线性回归获得类似Y=a+bX的线性方程，使用时将高倍镜下获得的血小板平均个数代入计算即可[6]。

(5) 血红蛋白因子法：同样在油镜下至少观察10个视野，计算每油镜视野中血小板平均数量，则血小板估测值(×109/L )=每油镜视野中血小板平均个数×血红蛋白浓度（g/dL）×109/L[7]。

上述方法中，R值法最简单，但不同文献R值的取值并不相同， 其范围在10-20之间。一般来说,获取R值需要选取一定量的样本，同时用涂片镜检和细胞计数仪计数，将两组结果进行最小二乘回归分析（least-squares regression analysis ），把获得的线性方程简化为Y=bX形式，并将系数进行取整处理[8]即可。使用该方法时仅考虑细胞是否均匀分布，并没有考虑RBC比容对结果的影响，涂片上细胞分布均匀、数目相同的视野，只要血小板数量相同就会得到相同的估测值，但细胞数量相同的视野由于血膜厚度不同，所代表的体积也有差异，虽然多样本统计上R值法和细胞计数仪法结果没有明显差异，但具体到某个样本，两种方法的结果可能差异显著，往往是贫血越严重估测误差越大，所以R值法只能作为极为粗略的估计方法。当前细胞计数仪在国内十分普及，一般血小板结果有疑问时，我们在涂片之前已经获得了红细胞和白细胞计数值，选择使用比值法更为便捷准确。

比值法估测血小板的原理是涂片上一定量的均匀分布的红细胞或白细胞代表着一定量的原样本体积，在与红细胞或白细胞相同视野中观察到的血小板数量就是在相同体积中的血小板数量。利用血小板/白细胞比值法可以获得较好的估测结果，白细胞较少时，使用血小板/红细胞比值法结果可能更为准确。计数红细胞时在目镜中放置Miller窥盘会提高计数准确性。

根据工作习惯不同，血小板/红细胞比值法有多种应用方式：

（a）理论上安邦权等[9]介绍的血涂片直接计数法较为准确，方法是根据红细胞计数值在油镜下选择均匀分布又含有相应数量红细胞的区域（譬如红细胞计数值为4.0×1012/L，选择 400个红细胞/油镜视野的区域），计数10个视野后求得每油镜视野血小板均数，血小板计数值=每油镜血小板均数×10×109/L，系数10×109/L 是通过(4.0×1012/L) /400计算获得。

（b）工作中所选择的区域不可能都达到“红细胞均匀分布、细胞间相互接触而无重叠”的标准，也不能保证每次选定的区域视野中红细胞数相同，可以根据红细胞计数值和油镜视野下红细胞的大致数量，按照方法（a）对系数进行简单计算，对血小板进行初步估测。譬如患者红细胞分别为2.0×1012/L和6.0×1012/L，而我们选择的红细胞均匀分布区域每油镜视野仍为400个红细胞，则血小板计数值分别等于每油镜血小板均数×5×109/L和每油镜血小板均数×15×109/L，可以简单记为系数分别为5和15。

（c）选择红细胞均匀分布的区域计数1000个红细胞，同时记录遇到的血小板数，求得血小板/红细胞比值，结果乘以细胞计数仪获得的红细胞计数值。

快速准确地评估视野中红细胞数量是应用血小板/红细胞比值法的基本前提，熟练掌握后该方法就成为便捷的复核工具，可以满足复核的基本要求。

至于线性方程方法和R值法原理相同且每次需要较为繁琐的计算，不方便临床使用，用血红蛋白浓度推测血小板数量被有些研究证明不如R值法准确。无论使用什么方法，当血小板足够低时，计数误差都会升高，用涂片法估测血小板严重减少的样本，也应增加观察视野数量。

涂片法简单方便，但血小板估值受推片技术、细胞分布、区域选择及仪器计数的WBC和RBC准确性等多环节、多因素影响，虽然熟练掌握比值法后估测结果的重复性能使CV值达到10%以下，但涂片估测法仍不能代替细胞计数仪方法，更不能代替参考方法，其更重要意义在于确认仪器计数结果，及时发现并排除可能影响计数结果的因素，诸如仪器故障、样本凝块、异常凝集、假性降低、血液病等，减少较大的检验误差，避免误导临床，为是否复查以及是否用参考方法复查提供依据。血小板较低的样本（PLT＜20×109/L）根据实验室条件选择荧光染料结合法或参考方法为宜[3]。

参考文献

[1] George Klee, Guiseppe D'Onofrio, Onno W. Van Assendelft，et al. Platelet Counting by the RBC/Platelet Ratio Method: A Reference Method[J].American Journal of clinical pathology,2001,115(3):460-464.

[2]WS/T 244-2005.中华人民共和国行业标准-PLT计数参考方法[S].

[3]李娟.低值血小板检测的方法学评价及影响因素分析[D].济南：山东大学硕士学位论文，2018.

[4]PW Barnes,SL Mcfadden,SJ Machin,et al.The international consensus group for hematology review:suggested criteria for action following automated CBC and WBC differential analysis[J]. Laboratory hematology,2005,11:83-90.

[5]王霄霞.外周血细胞形态学检查技术[M].北京：人民卫生出版社，2014:98.

[6]孙余，王平，王琳.高倍镜视野下血小板个数与血小板值的关系[J].检验医学，2019,34（3）：280-281.

[7]Sheila Lopez Torres,MS,MT(ASCP),et al.Platelet verification under microscope calculated by the patient,s hemoglobin[J].Laboratory medicine,Vol35(7):430-433.

[8] JS Nosanchuk,J Chang,JM Bennett.The analytic  basis for the use of platelet estimates from peripheral blood smears. Laboratory and clinical applications [J].1977,383-388.

[9]安邦权 ，凌晓午，刘青，等.血涂片法血小板计数方法学的建立及临床应用研究[J].贵州医药，2006,Vol 30（6）：18-20.

作者:  夏梦岩   解放军总医院京东医疗区

编辑：伟